Judith, in Blau gekleidet, beugt sich mit entschlossener Kraft nach vorne, während sie durch den Hals von Holofernes sägt, ihre linke Hand greift in sein Haar, während ihre Magd Abra seinen kämpfenden Körper festhält; Blut strömt über die weißen Laken und läuft über die Bettkante. Die Szene ist eng gerahmt, die Figuren sind eng beieinander gedrängt und werden von einem harten, gerichteten Licht beleuchtet, das ihre Gesichter und Arme gegen die umgebende Dunkelheit scharf hervorhebt. Judith tötet Holofernes nimmt sein Thema aus dem Buch Judith und zeigt die israelitische Heldin und ihre Dienerin beim Akt des Tötens des assyrischen Generals Holofernes, nachdem er eingeschlafen ist, wie es in der biblischen Geschichte beschrieben wird.

Artemisia Gentileschi vollendete dieses Gemälde 1612-13, und es wird heute als eines ihrer ikonischsten Werke anerkannt. Wissenschaftler bemerken, dass Gentileschis Komposition Judiths aktive physische Rolle betont, was sie von früheren Darstellungen männlicher Künstler unterscheidet, und Themen weiblicher Handlungsfähigkeit und Stärke innerhalb der barocken religiösen Kunst hervorhebt.