Judith, vêtue de bleu, se penche en avant avec une force déterminée alors qu'elle scie le cou d'Holoferne, sa main gauche agrippant ses cheveux pendant que sa servante Abra maintient son corps en lutte ; le sang coule sur les draps blancs et déborde du bord du lit. La scène est étroitement encadrée, les figures pressées les unes contre les autres et illuminées par une lumière dure et directionnelle qui met en relief leurs visages et bras contre l'obscurité environnante. Judith tuant Holoferne tire son sujet du Livre de Judith, montrant l'héroïne israélite et sa servante en train de tuer le général assyrien Holoferne après qu'il se soit endormi, comme le décrit l'histoire biblique.

Artemisia Gentileschi a achevé cette peinture en 1612-13, et elle est désormais reconnue comme l'une de ses œuvres les plus emblématiques. Les chercheurs notent que la composition de Gentileschi met en avant le rôle physique actif de Judith, la distinguant des représentations antérieures par des artistes masculins, et soulignant des thèmes d'agence et de force féminine dans l'art religieux baroque.