Judite, vestida de azul, inclina-se para frente com força determinada enquanto serrra o pescoço de Holofernes, com a mão esquerda segurando seu cabelo enquanto sua criada Abra imobiliza seu corpo em luta; o sangue flui sobre os lençóis brancos e transborda pela borda da cama. A cena é estreitamente emoldurada, as figuras pressionadas umas contra as outras e iluminadas por uma luz dura e direcional que destaca seus rostos e braços contra a escuridão ao redor. Judite Decapitando Holofernes toma seu tema do Livro de Judite, mostrando a heroína israelita e sua serva no ato de matar o general assírio Holofernes depois que ele adormeceu, conforme descrito na história bíblica.

Artemisia Gentileschi completou esta pintura em 1612-13, e agora é reconhecida como uma de suas obras mais icônicas. Os estudiosos observam que a composição de Gentileschi enfatiza o papel físico ativo de Judite, distinguindo-a de representações anteriores por artistas masculinos, e destacando temas de agência e força feminina dentro da arte religiosa barroca.