Judith, vestida de azul, se inclina hacia adelante con fuerza decidida mientras corta el cuello de Holofernes, con su mano izquierda agarrando su cabello mientras su sirvienta Abra sujeta su cuerpo en lucha; la sangre fluye sobre las sábanas blancas y se derrama por el borde de la cama. La escena está enmarcada de manera ajustada, las figuras presionadas unas contra otras e iluminadas por una luz dura y direccional que resalta sus rostros y brazos contra la oscuridad circundante. Judith decapitando a Holofernes toma su tema del Libro de Judith, mostrando a la heroína israelita y su sirvienta en el acto de matar al general asirio Holofernes después de que se ha quedado dormido, como se describe en la historia bíblica.

Artemisia Gentileschi completó esta pintura en 1612-13, y ahora se reconoce como una de sus obras más icónicas. Los estudiosos señalan que la composición de Gentileschi enfatiza el papel físico activo de Judith, distinguiéndola de representaciones anteriores por artistas masculinos, y destacando temas de agencia y fuerza femenina dentro del arte religioso barroco.