Eleonora Gonzaga se sienta ligeramente girada hacia la izquierda, con su mano derecha descansando sobre el oscuro pelaje de una marta, su mirada es serena y reservada. Lleva un vestido de terciopelo adornado con lazos dorados y un tocado bordado en oro, que evoca la moda del norte de Italia popularizada por Isabella d’Este. La joyería—perlas en forma de gota en su cuello, pendientes de perlas y anillos—señala su estatus y hace referencia a la pureza.

Un cinturón de cordón dorado con la cabeza de una marta engastada en joyas cuelga de su cintura, mientras que volantes de seda emergen de sus mangas y un cuello de seda blanca bordeado en oro enmarca su rostro. Detrás de ella, una ventana muestra un paisaje verde bajo un cielo azul, y una pequeña mesa debajo sostiene un perro manchado dormido y un reloj dorado ornamentado coronado con una estatuilla. El perro y el reloj, ambos motivos recurrentes en la obra de Tiziano, simbolizan la fidelidad y el paso del tiempo, y también reflejan los intereses de la corte de Urbino.

Retrato de Eleonora Gonzaga della Rovere fue pintado por Tiziano en la década de 1530 como un par con el retrato de su esposo, y se convirtió en un modelo para sus retratos posteriores. Esta obra pertenece a la escuela veneciana y su colorido y detalles recuerdan los colores heráldicos de la familia Montefeltro, de quienes los della Rovere heredaron su ducado.