Eleonora Gonzaga sitzt leicht nach links gedreht, ihre rechte Hand ruht auf dem dunklen Fell einer Marder, ihr Blick ist ruhig und zurückhaltend. Sie trägt ein Samtkleid, das mit goldenen Schleifen verziert ist, und eine mit Gold bestickte Kopfbedeckung, die die norditalienische Mode widerspiegelt, die von Isabella d’Este populär gemacht wurde. Schmuck—tropfenförmige Perlen um ihren Hals, Perlenohrringe und Ringe—weist auf ihren Status hin und verweist auf Reinheit.

Ein goldener Kordelgürtel mit einem mit Juwelen besetzten Marderkopf hängt von ihrer Taille, während Seidenpuffs aus ihren Ärmeln hervortreten und ein weißer Seidenkragen mit goldenen Rändern ihr Gesicht umrahmt. Hinter ihr zeigt ein Fenster eine grüne Landschaft unter einem blauen Himmel, und ein kleiner Tisch darunter hält einen schlafenden gescheckten Hund und eine aufwendige goldene Uhr, die mit einer Statuette gekrönt ist. Der Hund und die Uhr, beide wiederkehrende Motive in Tizians Werk, symbolisieren Treue und den Lauf der Zeit und spiegeln auch die Interessen des Hofes von Urbino wider.

Porträt von Eleonora Gonzaga della Rovere wurde von Tizian in den 1530er Jahren als Pendant zum Porträt ihres Mannes gemalt und wurde zu einem Modell für seine späteren Porträts. Dieses Werk gehört zur venezianischen Schule und seine Farbgebung und Details erinnern an die heraldischen Farben der Familie Montefeltro, von der die della Rovere ihr Herzogtum erbten.