Eleonora Gonzaga está sentada ligeiramente voltada para a esquerda, com a mão direita descansando sobre o pelo escuro de uma marta, seu olhar é calmo e reservado. Ela usa um vestido de veludo adornado com laços dourados e um tocado bordado em ouro, ecoando a moda do norte da Itália popularizada por Isabella d’Este. As joias—pérolas em forma de gota em seu pescoço, brincos de pérola e anéis—sinalizam seu status e fazem referência à pureza.

Um cinto de cordão dourado com a cabeça de uma marta cravejada de joias pende de sua cintura, enquanto punhos de seda emergem de suas mangas e um colar de seda branca com bordas douradas emoldura seu rosto. Atrás dela, uma janela mostra uma paisagem verde sob um céu azul, e uma pequena mesa abaixo sustenta um cachorro manchado dormindo e um relógio dourado ornamentado coroado com uma estatueta. O cachorro e o relógio, ambos motivos recorrentes na obra de Tiziano, simbolizam fidelidade e a passagem do tempo, além de refletir os interesses da corte de Urbino.

Retrato de Eleonora Gonzaga della Rovere foi pintado por Tiziano na década de 1530 como um par com o retrato de seu marido, e se tornou um modelo para seus retratos posteriores. Esta obra pertence à escola veneziana e sua coloração e detalhes lembram as cores heráldicas da família Montefeltro, da qual os della Rovere herdaram seu ducado.