Eleonora Gonzaga è seduta leggermente girata a sinistra, con la mano destra appoggiata sul pelo scuro di una martora, il suo sguardo è calmo e riservato. Indossa un abito di velluto adornato con fiocchi d’oro e un copricapo ricamato in oro, che richiama la moda del nord Italia popolarizzata da Isabella d’Este. I gioielli—perle a goccia al collo, orecchini di perle e anelli—segnalano il suo status e fanno riferimento alla purezza.

Una cintura di corda dorata con la testa di una martora incastonata di gioielli pende dalla sua vita, mentre soffici di seta emergono dalle sue maniche e un colletto di seta bianca bordato d’oro incornicia il suo viso. Dietro di lei, una finestra mostra un paesaggio verde sotto un cielo blu, e un piccolo tavolo sottostante sostiene un cane maculato addormentato e un orologio dorato ornato sormontato da una statuetta. Il cane e l’orologio, entrambi motivi ricorrenti nell’opera di Tiziano, simboleggiano la fedeltà e il passare del tempo, e riflettono anche gli interessi della corte di Urbino.

Ritratto di Eleonora Gonzaga della Rovere è stato dipinto da Tiziano negli anni 1530 come un pendant del ritratto di suo marito, ed è diventato un modello per i suoi ritratti successivi. Quest'opera appartiene alla scuola veneziana e la sua colorazione e i dettagli richiamano i colori araldici della famiglia Montefeltro, da cui i della Rovere ereditarono il loro ducato.