한 남자가 세례 요한의 생명이 없는 몸 위에 무릎을 꿇고, 그의 머리를 움켜잡고 목을 베기 위해 칼을 꺼내고 있다. 피가 땅에 고여 있고, 한 여성이 금색 쟁반을 들고 앞으로 몸을 숙여 잘린 머리를 받으려 하고 있다. 또 다른 여성은 충격을 받은 채 서서 손으로 얼굴을 가리고 있으며, 교도관이 지켜보는 가운데 두 인물이 어두운 창문에서 철창을 통해 엿보고 있다.

모든 것이 감옥의 차가운 돌벽을 배경으로 펼쳐진다. 카라바조는 이 처형의 순간을 극적인 빛과 그림자의 대비로 그리며, 선명한 빨강과 따뜻한 노랑을 사용하여 장면의 강렬함을 높이고 있다. 세례 요한의 참수는 1608년 말타 기사단을 위해 제작되었으며, 현재도 성 요한 공동 대성당의 오라토리오를 위한 제단화로 남아 있다.

이는 카라바조가 서명한 유일한 작품으로, 서명은 세례 요한의 목에서 흘러나오는 피 속에 새겨져 있다. 세례 요한의 참수라는 주제는 이탈리아 예술가들에게 인기 있는 테마였으며, 여기서는 성경의 텍스트가 아닌 '황금 전설'에서 해석되고 있다. 이 그림은 카라바조의 걸작으로 널리 여겨지며, 바로크 운동의 정의적인 작품으로 그 규모와 심리적 강도로 알려져 있다.