Un homme est à genoux sur le corps sans vie de Jean-Baptiste, tenant sa tête et sortant un couteau pour achever la décapitation, tandis que le sang s'accumule au sol et qu'une femme se penche en avant avec un plat doré pour recevoir la tête tranchée. Une autre femme se tient en état de choc, la main couvrant son visage, tandis qu'un geôlier observe et que deux figures regardent à travers des barres de fer d'une fenêtre sombre, le tout contre les dures murs de pierre d'une prison. Caravaggio peint ce moment d'exécution avec des contrastes dramatiques de lumière et d'ombre, utilisant des rouges vifs et des jaunes chauds pour intensifier la scène.

La Décapitation de Saint Jean-Baptiste a été achevée en 1608 pour les Chevaliers de Malte comme un retable pour l'Oratoire de la Co-Cathédrale de Saint Jean, où elle demeure. C'est la seule œuvre de Caravaggio à porter sa signature, inscrite dans le sang qui s'écoule de la gorge du Baptiste. Le sujet, la décapitation de Jean-Baptiste, était un thème populaire pour les artistes italiens et est ici interprété non pas à partir du texte biblique, mais de la Légende Dorée.

La peinture est largement considérée comme le chef-d'œuvre de Caravaggio et une œuvre définissante du mouvement baroque, par son échelle et son intensité psychologique.