Um homem se ajoelha sobre o corpo sem vida de João Batista, segurando sua cabeça e puxando uma faca para completar a decapitação, enquanto o sangue se acumula no chão e uma mulher se inclina para frente com um prato dourado para receber a cabeça cortada. Outra mulher está em choque, com a mão cobrindo o rosto, enquanto um carcereiro observa e duas figuras espiam através de barras de ferro de uma janela escura, tudo isso contra as duras paredes de pedra de uma prisão. Caravaggio pinta este momento de execução com dramáticos contrastes de luz e sombra, usando vermelhos vívidos e amarelos quentes para intensificar a cena.

A Decapitação de São João Batista foi completada em 1608 para os Cavaleiros de Malta como um altar para o Oratório da Co-Catedral de São João, onde permanece. Esta é a única obra de Caravaggio que leva sua assinatura, inscrita no sangue que jorra da garganta do Batista. O tema, a decapitação de João Batista, era um tema popular para artistas italianos e aqui é interpretado não a partir do texto bíblico, mas da Legenda Dourada.

A pintura é amplamente considerada a obra-prima de Caravaggio e uma obra definidora do movimento barroco, com sua escala e intensidade psicológica.