Un uomo è in ginocchio sopra il corpo senza vita di Giovanni Battista, stringendo la sua testa e estraendo un coltello per completare la decapitazione, mentre il sangue si accumula a terra e una donna si piega in avanti con un piatto dorato per ricevere la testa mozzata. Un'altra donna è in stato di shock, con la mano che copre il suo volto, mentre un carceriere osserva e due figure sbirciano attraverso le barre di ferro da una finestra buia, il tutto contro le dure pareti di pietra di una prigione. Caravaggio dipinge questo momento di esecuzione con drammatici contrasti di luce e ombra, utilizzando rossi vividi e gialli caldi per intensificare la scena.

La decapitazione di San Giovanni Battista è stata completata nel 1608 per i Cavalieri di Malta come pala d'altare per l'Oratorio della Co-Cattedrale di San Giovanni, dove rimane. Questa è l'unica opera di Caravaggio a portare la sua firma, iscritta nel sangue che sgorga dalla gola del Battista. Il soggetto, la decapitazione di Giovanni Battista, era un tema popolare per gli artisti italiani e qui è interpretato non dal testo biblico, ma dalla Legenda Aurea.

Il dipinto è ampiamente considerato il capolavoro di Caravaggio e un'opera definitoria del movimento barocco, per la sua scala e intensità psicologica.