Un hombre se arrodilla sobre el cuerpo sin vida de Juan el Bautista, sujetando su cabeza y sacando un cuchillo para completar la decapitación, mientras la sangre se acumula en el suelo y una mujer se inclina hacia adelante con un plato dorado para recibir la cabeza cortada. Otra mujer se queda en estado de shock, con la mano cubriendo su rostro, mientras un carcelero observa y dos figuras miran a través de barrotes de hierro desde una ventana oscura, todo enmarcado por las duras paredes de piedra de una prisión. Caravaggio pinta este momento de ejecución con dramáticos contrastes de luz y sombra, utilizando rojos vívidos y amarillos cálidos para intensificar la escena.

La decapitación de San Juan Bautista fue completada en 1608 para los Caballeros de Malta como un retablo para el Oratorio de la Co-Catedral de San Juan, donde permanece. Esta es la única obra de Caravaggio que lleva su firma, inscrita en la sangre que brota de la garganta del Bautista. El tema, la decapitación de Juan el Bautista, fue un tema popular para los artistas italianos y aquí se interpreta no desde el texto bíblico, sino desde la Leyenda Dorada.

La pintura es considerada ampliamente como la obra maestra de Caravaggio y una obra definitoria del movimiento barroco, por su escala e intensidad psicológica.