Ein Mann kniet über dem leblosen Körper von Johannes dem Täufer, hält seinen Kopf und zieht ein Messer, um die Enthauptung zu vollenden, während das Blut am Boden sich sammelt und eine Frau sich nach vorne beugt mit einem goldenen Teller, um den abgetrennten Kopf zu empfangen. Eine andere Frau steht schockiert da, ihre Hand bedeckt ihr Gesicht, während ein Gefängniswärter zusieht und zwei Figuren durch Eisenstäbe von einem dunklen Fenster spähen, alles vor den harten Steinmauern eines Gefängnisses. Caravaggio malt diesen Moment der Hinrichtung mit dramatischen Kontrasten von Licht und Schatten, indem er lebendige Rottöne und warme Gelbtöne verwendet, um die Intensität der Szene zu steigern.

Die Enthauptung des Heiligen Johannes des Täufers wurde 1608 für die Malteserritter als Altarbild für das Oratorium der Co-Kathedrale St. Johannes vollendet, wo es bis heute bleibt. Dies ist das einzige Werk von Caravaggio, das seine Signatur trägt, die im Blut eingraviert ist, das aus dem Hals des Täufers strömt.

Das Thema, die Enthauptung von Johannes dem Täufer, war ein beliebtes Motiv für italienische Künstler und wird hier nicht aus dem biblischen Text, sondern aus der Goldenen Legende interpretiert. Das Gemälde gilt weithin als Caravaggios Meisterwerk und als ein prägendes Werk der Barockbewegung, mit seiner Größe und psychologischen Intensität.