Poucas pinturas de El Greco geraram tanto debate entre os estudiosos quanto A Virgem e o Menino com Santa Ana. Embora a comissão exata permaneça incerta, a obra é notável por seu tema raro na produção do artista e pela existência de pelo menos outra versão, agora no Museu do Prado. A energia turbulenta da pintura e as figuras alongadas levaram alguns a especular que ela foi feita para devoção privada em vez de exibição pública.

Sua composição incomum e a interação terna, quase teatral, entre as figuras a tornaram um marco para discussões sobre o estilo maduro de El Greco por volta de 1600. No coração da cena, Santa Ana, mãe da Virgem Maria, senta-se protetora atrás de sua filha e do Menino Cristo. El Greco escolhe um momento de contato íntimo: a mão de Ana repousa suavemente sobre o ombro de Maria, enquanto Maria se inclina para frente, apresentando o menino Jesus ao espectador. O trio está preso em um abraço triangular, com suas formas alongadas e gestos expressivos, típicos do período tardio de El Greco.

O drapeado em espiral e a luz etérea focam a atenção no Menino Cristo, que levanta a mão em bênção. Ao contrário da famosa A Virgem e o Menino com Santa Ana de Leonardo, que enfatiza a complexidade psicológica, a versão de El Greco é toda sobre a imediata espiritualidade e o vínculo místico entre gerações. A jornada desta pintura pela história não está totalmente documentada, mas é geralmente aceito que foi criada durante os anos prolíficos de El Greco em Toledo, por volta de 1600. Seu estilo reflete a maneira tardia do artista, quando suas figuras se tornaram mais alongadas e suas cores mais ousadas.

A procedência da pintura antes de entrar no sistema museológico moderno é incerta, um destino comum para muitas obras de El Greco que foram produzidas para patronos locais ou instituições religiosas na Espanha. Hoje, A Virgem e o Menino com Santa Ana se ergue como um testemunho da visão única do artista, unindo a tradição bizantina e as alturas expressivas do Renascimento espanhol.