Ein Soldat und eine Frau konfrontieren einen älteren Mann in einem schwach beleuchteten Raum; sie deutet auf ihn, während er zurückweicht, die Hände erhoben in ängstlicher Ablehnung. Die Verleugnung des heiligen Petrus zeigt den Moment, in dem Petrus leugnet, Jesus nach der Festnahme zu kennen, wobei der heilige Petrus, ein Soldat und eine Frau in halber Länge und in Lebensgröße dargestellt sind. Caravaggio vollendete dieses Werk um 1610, wahrscheinlich in Neapel, und es gilt als eines seiner letzten beiden Gemälde.

Das Gemälde gelangte bald in die Hände des Malers Guido Reni, der es 1613 zur Begleichung von Schulden verwendete, und sein Einfluss ist in Werken von José de Ribera und Lionello Spada zu sehen. Die Verleugnung des heiligen Petrus gehört zur Barockbewegung, und seine dramatische Komposition und Beleuchtung sind charakteristisch für Caravaggios späten Stil.