Um soldado e uma mulher confrontam um homem mais velho em uma sala mal iluminada; ela gesticula em direção a ele enquanto ele recua, com as mãos levantadas em uma negação ansiosa. A Negação de São Pedro mostra o momento em que Pedro nega conhecer Jesus após a prisão, com São Pedro, um soldado e uma mulher representados até a metade e em tamanho real. Caravaggio completou esta obra por volta de 1610, provavelmente em Nápoles, e é considerada uma de suas duas últimas pinturas.

A pintura logo passou para as mãos do pintor Guido Reni, que a usou para saldar dívidas em 1613, e sua influência pode ser vista em obras de José de Ribera e Lionello Spada. A Negação de São Pedro pertence ao movimento barroco, e sua composição dramática e iluminação são características do estilo tardio de Caravaggio.