Un soldato e una donna affrontano un uomo più anziano in una stanza poco illuminata; lei gli fa un gesto mentre lui si ritrae, con le mani alzate in una negazione ansiosa. La Negazione di San Pietro mostra il momento in cui Pietro nega di conoscere Gesù dopo l'arresto, con San Pietro, un soldato e una donna rappresentati a mezzo busto e a grandezza naturale. Caravaggio completò quest'opera intorno al 1610, probabilmente a Napoli, ed è considerata uno dei suoi ultimi due dipinti.

Il dipinto passò presto nelle mani del pittore Guido Reni, che lo utilizzò per saldare debiti nel 1613, e la sua influenza è visibile in opere di José de Ribera e Lionello Spada. La Negazione di San Pietro appartiene al movimento barocco, e la sua composizione drammatica e l'illuminazione sono caratteristiche dello stile tardivo di Caravaggio.