Christ steht links und führt die Hand eines bärtigen Mannes, während dieser seinen Finger in die Wunde an Christi Seite drückt, während zwei andere Männer sich vorbeugen, ihre Gesichter aufmerksam und hell erleuchtet vor einem dunklen Hintergrund. Die zentrale Figur mit zerrissener Kleidung und Schmutz unter den Fingernägeln ist Thomas der Apostel, dessen Unglauben in diesem Moment durch den direkten Kontakt mit dem auferstandenen Körper Jesu überwunden wird, wie im Johannesevangelium erzählt. Caravaggio komponiert die vier Figuren in einer engen Gruppe, deren Köpfe ein Dreieck von Blicken bilden, die auf den Akt des Berührens fokussiert sind, wobei ein starkes Chiaroscuro das Drama verstärkt und den Betrachter in die Szene hineinzieht.

Um 1601–1602 für Vincenzo Giustiniani gemalt, gelangte Die Ungläubigkeit des Thomas später in die Königliche Sammlung von Preußen und überstand den Zweiten Weltkrieg unbeschadet. Die Abwesenheit eines Heiligenscheins und die Betonung der Körperlichkeit Christi spiegeln Caravaggios Ansatz zur religiösen Kunst innerhalb der italienischen Barockbewegung wider.