Cristo si trova a sinistra, guidando la mano di un uomo barbuto mentre preme il dito nella ferita del costato di Cristo, mentre altri due uomini si inclinano, i loro volti attenti e illuminati contro uno sfondo scuro. La figura centrale, con abiti strappati e sporco sotto le unghie, è Tommaso l'Apostolo, la cui incredulità viene superata in questo momento dal contatto diretto con il corpo risorto di Gesù, come raccontato nel Vangelo di Giovanni. Caravaggio compone le quattro figure in un raggruppamento compatto, con le loro teste che formano un triangolo di sguardi focalizzati sull'atto di toccare, con un forte chiaroscuro che intensifica il dramma e attira lo spettatore nella scena.

Dipinta intorno al 1601–1602 per Vincenzo Giustiniani, L'Incredulità di San Tommaso entrò successivamente nella Collezione Reale di Prussia e sopravvisse alla Seconda Guerra Mondiale illesa. L'assenza di un'aureola e l'accento sulla fisicità di Cristo riflettono l'approccio di Caravaggio all'arte religiosa all'interno del movimento barocco italiano.