Christ se tient à gauche, guidant la main d'un homme barbu alors qu'il presse son doigt dans la plaie du côté de Christ, tandis que deux autres hommes se penchent, leurs visages attentifs et éclairés contre un fond sombre. La figure centrale, vêtue de vêtements déchirés et avec de la terre sous les ongles, est Thomas l'Apôtre, dont l'incrédulité est surmontée à ce moment par le contact direct avec le corps ressuscité de Jésus, comme le raconte l'Évangile de Jean. Caravaggio compose les quatre figures dans un regroupement serré, leurs têtes formant un triangle de regards concentrés sur l'acte de toucher, avec un fort clair-obscur qui intensifie le drame et attire le spectateur dans la scène.

Peinte vers 1601–1602 pour Vincenzo Giustiniani, L'Incrédulité de Saint Thomas est ensuite entrée dans la Collection Royale de Prusse et a survécu à la Seconde Guerre mondiale indemne. L'absence d'un halo et l'accent mis sur la physicalité du Christ reflètent l'approche de Caravaggio envers l'art religieux dans le mouvement baroque italien.