Cristo está à esquerda, guiando a mão de um homem barbado enquanto ele pressiona seu dedo na ferida do lado de Cristo, enquanto outros dois homens se inclinam, seus rostos atentos e iluminados contra um fundo escuro. A figura central, com roupas rasgadas e sujeira sob as unhas, é Tomé, o Apóstolo, cuja incredulidade é superada neste momento pelo contato direto com o corpo ressuscitado de Jesus, conforme narrado no Evangelho de João. Caravaggio compõe as quatro figuras em um agrupamento apertado, com suas cabeças formando um triângulo de olhares focados no ato de tocar, com um forte claroscuro que intensifica o drama e atrai o espectador para a cena.

Pintada por volta de 1601–1602 para Vincenzo Giustiniani, A Incredulidade de Santo Tomé mais tarde entrou na Coleção Real da Prússia e sobreviveu à Segunda Guerra Mundial ilesa. A ausência de um halo e a ênfase na fisicalidade de Cristo refletem a abordagem de Caravaggio à arte religiosa dentro do movimento barroco italiano.