Cristo se encuentra a la izquierda, guiando la mano de un hombre barbado mientras presiona su dedo en la herida del costado de Cristo, mientras otros dos hombres se inclinan, sus rostros atentos y iluminados contra un fondo oscuro. La figura central, con ropa desgarrada y tierra bajo las uñas, es Tomás el Apóstol, cuya incredulidad se supera en este momento por el contacto directo con el cuerpo resucitado de Jesús, como se narra en el Evangelio de Juan. Caravaggio compone las cuatro figuras en un agrupamiento compacto, con sus cabezas formando un triángulo de miradas centradas en el acto de tocar, con un fuerte claroscuro que intensifica el drama y atrae al espectador a la escena.

Pintada alrededor de 1601–1602 para Vincenzo Giustiniani, La incredulidad de Santo Tomás entró más tarde en la Colección Real de Prusia y sobrevivió a la Segunda Guerra Mundial ilesa. La ausencia de un halo y el énfasis en la fisicalidad de Cristo reflejan el enfoque de Caravaggio hacia el arte religioso dentro del movimiento barroco italiano.