Ein Lichtstrahl durchschneidet einen dunklen Raum und beleuchtet eine Gruppe von Männern, die an einem Tisch versammelt sind, während zwei Figuren von rechts eintreten; einer der Neuankömmlinge streckt seinen Arm aus und zeigt direkt auf einen bärtigen Mann, der überrascht zurückgestikuliert. Caravaggio malt den Moment, als Jesus Matthäus, den Zöllner, ruft, ihm zu folgen, und fängt den Augenblick der spirituellen Erweckung ein, der im Evangelium des Matthäus beschrieben wird. Die meisten Kunsthistoriker identifizieren den bärtigen Mann in der Mitte als Matthäus, der von Christi Ruf überrascht ist und sich darauf vorbereitet, von seinem Platz aufzustehen.

Die Berufung des Heiligen Matthäus wurde für die Contarelli-Kapelle in San Luigi dei Francesi, Rom, geschaffen, als Teil einer Serie über das Leben von Matthäus, gemäß den Anweisungen des Kardinals Matthieu Cointerel und verwirklicht durch das Eingreifen von Caravaggios Mäzen, Kardinal Francesco Maria del Monte. Dieser Auftrag markierte Caravaggios erstes großes öffentliches Projekt mit mehreren Figuren, einen Wendepunkt in seiner Karriere und einen prägendes Moment für die barocke Religionsmalerei.