Un raggio di luce attraversa una stanza buia, illuminando un gruppo di uomini riuniti attorno a un tavolo mentre due figure entrano da destra; uno dei nuovi arrivati allunga il braccio, puntando direttamente verso un uomo barbuto che gesticola in risposta, sorpreso. Caravaggio dipinge il momento in cui Gesù chiama Matteo, il pubblicano, a seguirlo, catturando l'istante di risveglio spirituale descritto nel Vangelo di Matteo. La maggior parte degli storici dell'arte identifica l'uomo barbuto al centro come Matteo, sorpreso dalla chiamata di Cristo e pronto a alzarsi dal suo posto.

La Vocazione di San Matteo è stata creata per la Cappella Contarelli a San Luigi dei Francesi, Roma, come parte di una serie sulla vita di Matteo, seguendo le istruzioni lasciate dal cardinale Matthieu Cointerel e realizzata grazie all'intervento del mecenate di Caravaggio, il cardinale Francesco Maria del Monte. Questo incarico ha segnato il primo grande progetto pubblico di Caravaggio con più figure, un punto di svolta nella sua carriera e un momento definitorio per la pittura religiosa barocca.